为什么有的蛋白电泳呈现清晰单一条带，有的却能观察到完整复合物？为什么有的实验需要加热煮沸，有的却必须低温操作？答案在于凝胶系统的选择——非变性电泳（Native-PAGE） 与 变性电泳（SDS-PAGE）。两者基于相同原理，却在分离机制和应用场景上有着本质区别。
本文将分上下两篇，系统解析两种技术的异同，并整理非变性电泳实操全攻略，助您一步到位掌握核心要点。
两种技术的核心差异
蛋白质在电泳过程中保持其天然构象，迁移速率由天然电荷密度、分子大小和空间构象共同决定。其中，蛋白质的等电点（pI） 是最关键的调控因素。由于体系中不含SDS等变性剂，蛋白质的固有电荷未被掩盖，因此不同蛋白质的电荷异质性得以保留，迁移行为由其综合物化属性决定。
1.2 SDS-PAGE
在阴离子去垢剂SDS存在下，蛋白质被完全变性并解聚为多肽链。SDS以恒定比例（1.4 g SDS / g 蛋白）与蛋白质结合，有效屏蔽蛋白质的固有电荷，使所有蛋白质-SDS复合物均带有均匀的负电荷密度。同时，SDS诱导蛋白质从天然构象转变为无规卷曲/长杆状，消除了形状对迁移的影响。最终，蛋白质的迁移速率仅与其分子量的对数呈线性相关——分子量越小，迁移距离越大。
2.1 Native-PAGE
• 蛋白质状态：保持天然三维构象，生物活性得以保留，亚基间相互作用及寡聚化状态完整。
• 电荷特征：蛋白质携带其固有净电荷。大多数蛋白质的等电点（pI）在3-8之间，在常规Tris-甘氨酸缓冲体系（pH ~8.3）中带负电，因此向阳极迁移；若蛋白质pI＞7（碱性蛋白），则需反转电极极性以实现有效分离。
• 可观测信息：可直接解析蛋白质的天然寡聚状态（如单体、二聚体、多聚体）及蛋白质复合物组成，电泳后还可进行原位酶活性染色或同工酶分析。
2.2 SDS-PAGE
• 蛋白质状态：完全变性、解聚为多肽链，天然构象及生物活性丧失。
• 电荷特征：所有蛋白质-SDS复合物均带负电荷，因此在电场中均向阳极迁移。
• 可观测信息：获得单一亚基的清晰条带，可根据条带相对迁移距离推算表观分子量，适用于蛋白质表达分析、纯度鉴定等。
3.1 Native-PAGE
• 天然蛋白质复合物的分离与分析：从组织匀浆或膜组分中一步分离具有生物学活性的蛋白质复合物。
• 寡聚状态及相互作用研究：确定蛋白质的天然分子量、亚基组成及生理条件下的蛋白质-蛋白质相互作用。
• 功能活性检测：电泳后直接进行酶活性染色、配体结合分析等功能性实验。
• 结构生物学样品制备：从凝胶中回收天然蛋白质复合物，用于二维结晶、负染电镜等结构解析前处理。
3.2 SDS-PAGE
• 分子量测定：根据标准曲线计算蛋白质亚基的表观分子量。
• 蛋白质表达分析：检测目标蛋白质的表达水平、诱导表达效果及样品间差异。
• Western blot前处理：变性后的蛋白质更易于与抗体结合，是免疫印迹实验的标准流程。
• 纯度评估：监测蛋白质纯化过程中各流份的纯度和降解情况。
4.1 Native-PAGE
✅ 保留蛋白质天然构象与活性，可获得功能相关的结构信息
✅ 支持电泳后直接进行功能检测，无需额外复性步骤
❌ 实验条件需优化（如缓冲液pH、凝胶浓度、电极方向），操作复杂度较高
❌ 迁移行为受多重因素影响，无法直接推算分子量
4.2 SDS-PAGE
✅ 操作标准化程度高，实验重复性好，适用范围广
✅ 分子量测定准确，数据易于定量分析
✅ 样品处理简单（热变性即可），适合高通量分析
❌ 蛋白质完全变性，无法获得天然构象及功能相关信息
非变性电泳（Native-PAGE）操作全攻略
关键要点：
• 所有的预染蛋白Marker均为SDS-PAGE设计，不适用于非变性电泳。
• 非变性条件下，蛋白质迁移受电荷、形状和分子量共同影响，因此在单一凝胶浓度下，非变性蛋白Marker无法精确推算目标蛋白的分子量。
• 如需确定非变性条件下蛋白质的分子量，应在不同凝胶浓度下测定蛋白质的相对迁移率（Rf值），绘制凝胶浓度对Rf的曲线进行推算。
• 非变性蛋白专用Marker为保持天然结构，均未偶联染料，电泳过程中不可见。如需检测非变性蛋白Marker的转膜效果，可使用丽春红染色液，但需注意其灵敏度较低，可能无法显示完整条带。
推荐产品： MKPZ010 非变性蛋白 Marker (66-669 kDa)
关键要点：
• 必须使用非变性上样缓冲液，确保不含SDS、DTT等变性剂。
• 严禁加热样品，室温或冰上操作即可，避免热诱导变性。
关键要点：
• 凝胶和电泳缓冲液中均不得添加SDS。
• 常规蛋白质（pI 3-8）按常规方向电泳（向阳极迁移）；若目标蛋白pI＞7（碱性蛋白），需反转电极电泳，常规蛋白（pI＜7）按常规向阳极迁移；
• 电泳过程中产热可能导致蛋白质变性，建议在电泳槽外置冰浴降温。
• 非变性条件下蛋白质分子量较大，推荐使用5%-10%的凝胶浓度。
• 非变性蛋白质荷质比较低，泳动速度较慢，需适当延长电泳时间。
关键要点：
• 转膜缓冲液中的甲醇对蛋白质有固定作用，非变性转膜应少加或不加甲醇。
• 以下转膜条件为通用参考值，建议根据目标蛋白特性进行1-2次预实验优化：
• 膜孔径选择：>20 kD蛋白选用0.45 μm孔径，≤20 kD蛋白选用0.22 μm孔径。PVDF膜使用前需用无水甲醇润湿活化。
只要抓住 “保留天然状态” 这一核心，严格把控样品、电泳、转膜的每一个细节，避开变性雷区，非变性电泳也能轻松做好。
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Native-PAGE 与 SDS-PAGE：前者解析天然状态，后者聚焦分子量信息。
明确实验目的，选择适配方法，方能获得可靠的实验结果。
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读完这篇干货，你对Native-PAGE和SDS-PAGE的区别是否更清晰了？欢迎在评论区留言交流：
📌你在实验中选择Native-PAGE还是SDS-PAGE？主要研究什么类型的蛋白？
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